Detecção específica da atividade de semeadura de tau na doença de Alzheimer usando células biossensoras racionalmente projetadas

Neurodegeneração Molecular volume 18, Artigo número: 53 (2023) Citar este artigo

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A propagação da tau semelhante ao príon em distúrbios neurodegenerativos implica que a tau patológica mal dobrada pode recrutar a proteína normal e modelar sua agregação. Aqui, relatamos os métodos para o desenvolvimento de linhas celulares de biossensores sensíveis para a detecção da atividade de semeadura de tau.

Realizamos o projeto racional de novas sondas de tau com base no conhecimento estrutural atual de agregados patológicos de tau na doença de Alzheimer. Geramos linhas celulares estáveis ​​de biossensores baseadas em transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) e caracterizamos sua sensibilidade, especificidade e capacidade geral de detectar tau bioativa em amostras humanas. Em comparação com a linha de biossensores de referência, o design otimizado da sonda resultou em maior eficiência na detecção de semeadura de tau. O aumento da sensibilidade permitiu a detecção de menor quantidade de competência de semeadura de tau em amostras de cérebro humano, preservando ao mesmo tempo a especificidade para sementes de tau encontradas na doença de Alzheimer.

Esta próxima geração de células biossensoras baseadas em FRET é uma nova ferramenta para estudar a atividade de semeadura de tau em amostras humanas com doença de Alzheimer, especialmente em amostras com baixos níveis de atividade de semeadura, o que pode ajudar no estudo de eventos patológicos precoces relacionados à tau.

O acúmulo cerebral da proteína tau associada aos microtúbulos (MAPT) em agregados insolúveis é uma característica neuropatológica importante da doença de Alzheimer (DA) e de outros distúrbios neurodegenerativos conhecidos como tauopatias. Tau é uma proteína intrinsecamente desordenada normalmente presente no compartimento axonal dos neurônios, onde desempenha um papel na estabilização dos microtúbulos. Na DA, formas hiperfosforiladas de tau acumulam-se no citoplasma e agregam-se em filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) que são estruturas filamentosas de folha beta pregueada [1, 2]. O estadiamento estereotipado de Braak da patologia tau da DA do córtex entorrinal, ao hipocampo e, posteriormente, às regiões límbicas [3], correlaciona-se com a perda de neurônios e o curso dos sintomas clínicos [4,5,6,7,8]. A disseminação de agregados de tau por regiões anatômicas interconectadas é apoiada por um forte conjunto de evidências. Por exemplo, animais transgênicos que superexpressam a tau mutante P301L na camada II do córtex entorrinal desenvolvem agregados de tau humana no giro dentado, modelando a tau endógena de camundongo no processo [9]. A capacidade dos agregados de tau mal dobrados de recrutar tau normal em um mecanismo “semelhante ao príon” é chamada de semeadura e foi replicada em vários modelos experimentais [10,11,12,13]. O papel da semeadura na propagação da patologia humana é apoiado pela detecção de tau competente para semeadura (também conhecida como tau bioativa) em regiões do cérebro contendo patologia evidente do emaranhado neurofibrilar, mas também em regiões subsequentes que estão livres de alterações patológicas evidentes, mais adiante na via de Braak [14]. A propensão de semeadura de tau em cérebros post-mortem correlaciona-se com a taxa de progressão clínica, confirmando o papel fundamental desse fenômeno na DA [15, 16].

O estudo dos mecanismos de semeadura na patologia da DA foi grandemente acelerado pelo desenvolvimento de uma linha celular biossensora de tau baseada na transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) [12]. Esta linha celular estável de rim embrionário humano (HEK 293 T) expressa sondas que são um mutante pró-agregação P301S do domínio de repetição tau 4R (RD, aminoácidos 244-372) fundido a uma proteína fluorescente ciano (CFP) ou a uma proteína fluorescente amarela (YFP). A adição de material tau competente para semeadura derivado do cérebro da DA ou de fibrilas de tau pré-formadas induz a agregação dessas sondas fluorescentes e subsequente sinal FRET. O sinal FRET pode ser quantificado por citometria de fluxo 24 horas após a incubação com sementes de tau. Para aumentar a sensibilidade da detecção de sementes, os lipossomas são misturados com material competente para semeadura para transduzir as sementes nas células [17]. Na ausência de lipossomas, as células biossensoras podem ser usadas para estudar os mecanismos de captação de sementes [18, 19]. Células biossensoras de tau têm sido usadas para amplificar e quantificar especificamente pequenas quantidades de tau bioativa de várias amostras de DA, incluindo extratos de cérebro usando vários métodos de purificação, líquido cefalorraquidiano (LCR) post-mortem, LCR lombar antemortem ou vesículas extracelulares derivadas do cérebro [20,21,22 ,23,24].