Análise comparativa da eficácia do desenvolvimento de coquetel de fagos contra múltiplos sorovares de Salmonella e sua atividade de controle de biofilme

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 13054 (2023) Citar este artigo

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As doenças transmitidas por alimentos são um grande desafio na indústria alimentar global, especialmente aquelas causadas por bactérias multirresistentes (MDR). Bactérias capazes de formar biofilme, além das cepas MDR, reduzem a eficácia do tratamento, representando uma ameaça significativa ao controle bacteriano. Os bacteriófagos, vírus que infectam e matam bactérias, são considerados uma alternativa promissora no combate às bactérias MDR, tanto na medicina humana quanto na produção animal. Coquetéis de fagos, compreendendo múltiplos fagos, são comumente empregados para ampliar a gama de hospedeiros e prevenir ou retardar o desenvolvimento de resistência aos fagos. Existem inúmeras técnicas e protocolos disponíveis para avaliar a atividade lítica dos bacteriófagos, sendo os métodos mais comumente utilizados ensaios de teste pontual, eficiência de plaqueamento (EOP) e ensaios de infecção em cultura líquida. No entanto, atualmente não existe uma padronização para quais análises devem ser empregadas e as possíveis diferenças entre elas, a fim de determinar com precisão a gama de hospedeiros dos fagos e a composição de um coquetel. Uma selecção preliminar utilizando o Spot Test Assay resultou em quatro fagos para avaliação subsequente contra um painel de 36 isolados de Salmonella de numerosos serovares. A comparação dos ensaios de EOP e de infecção em cultura líquida revelou que a EOP poderia subestimar a atividade lítica dos fagos, influenciando diretamente o desenvolvimento do coquetel de fagos. Além disso, o coquetel de fagos contendo os quatro fagos selecionados foi capaz de controlar ou remover biofilmes formados por 66% (23/35) dos isolados, incluindo aqueles que apresentam baixa suscetibilidade aos fagos, segundo EOP. Os fagos foram caracterizados genomicamente, revelando a ausência de genes associados à resistência a antibióticos, fatores de virulência ou integrases. De acordo com a análise confocal de microscopia de varredura a laser, a maturação do biofilme de um isolado de Salmonella, que exibiu alta suscetibilidade a fagos em cultura líquida e ensaios de viabilidade de biofilme em placas de 96 poços, mas apresentou valores baixos para EOP, foi inibida e controlada pelo fago coquetel. Estas observações indicam que os fagos poderiam controlar e remover biofilmes de Salmonella ao longo do seu processo de crescimento e maturação, apesar dos seus baixos valores de EOP. Além disso, o uso de ensaios de infecção em cultura líquida permite um estudo mais preciso das interações dos fagos para a concepção de coquetéis de forma atemporal e sem esforço. Assim, a integração de estratégias e técnicas para avaliar de forma abrangente a gama de hospedeiros e a atividade lítica dos bacteriófagos sob diferentes condições pode demonstrar com mais precisão o potencial antibacteriano dos coquetéis de fagos.

Salmonela spp. são um patógeno humano frequente, reconhecido mundialmente como uma ameaça à saúde pública1. Entre os agentes patogénicos de origem alimentar, a Salmonella é classificada como a terceira principal causa de morte e, portanto, também representa um fardo económico significativo. O último relatório da Organização Mundial de Saúde sobre o fardo global das doenças de origem alimentar estimou que dos 88 milhões de casos anuais causados por Salmonella em todo o mundo, 123.000 resultaram em morte e um total de 222.000 anos de vida foram vividos com incapacidade1.

Uma das principais características da Salmonella spp. O que permite sua sobrevivência em ambientes hostis é a formação de comunidades complexas associadas à superfície – biofilmes – o que dificulta o controle de sua proliferação, especialmente em granjas avícolas, já que mais de 50% das cepas de Salmonella isoladas de frangos abatidos no Brasil demonstram a capacidade formar biofilmes2,3,4,5. Os biofilmes aumentam a tolerância aos biocidas6,7, dada a organização das células dentro da matriz polimérica, o que reduz a penetração do agente biocida e faz com que as bactérias persistam em ambientes de processamento de alimentos por longos períodos5,8.

Portanto, é de grande importância o desenvolvimento de estratégias de controle de Salmonella na produção avícola, visando reduzir o uso de antibióticos devido ao surgimento de microrganismos multirresistentes9,10. Nesse cenário, os bacteriófagos vêm ganhando interesse como agentes inibidores ou rompedores de biofilmes11,12,13.

0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.001./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001./p> 107 CFU/mL) of host strain, we assume that 100% phage adsorption has occurred soon following phage addition25./p>

0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) was observed for phage treated compared to 48 h biofilm control, indicating that the phages in the cocktail did not increase biofilms' growth for any tested isolates./p> 70%), they are from different species (< 95%). The intergenomic similarity between phB7 and phC17 is 86.5%, which also classifies them as different species in the same genus (Fig. 7b). This is reaffirmed by phylogeny analysis by VICTOR34, which grouped the four phages within the same family and genus. However, VICTOR results differentiated all the phages in different species, including phA11 and phC11, although their phylogenetic distance is low (Fig. 7c). This difference between VIRIDIC and VICTOR results regarding species level can be explained by the difference in the calculations and species thresholds used for each one. All four phages were classified in the class Caudoviricetes, family Demerecviridae, subfamily Markadamsvirinae, and genus Tequintavirus./p> 90%) with only five different phages, infecting Salmonella enterica, Shigella sp., and Escherichia coli. For phages phC17/phB7 endolysin genes, BLASTn showed high similarity (> 90%) with seventy-five different phages, infecting Salmonella enterica, Escherichia coli, and Klebsiella pneumoniae./p> 0.05, two-way ANOVA and post hoc Tukey’s multiple comparison test) increase the growth of the biofilm for any of the tested isolates in the analysis, reinforcing the high lytic activity of the selected phages. This is of special interest since specific phages modulate several properties of their host, including the possibility of increasing biofilm production45. A more detailed analysis of the interaction of the phages with the Salmonella biofilm can be seen in the CLSM images. At 24 h of incubation, the biofilm was not mature, but initial cell clusters can be observed with high thickness. A phage cocktail applied at this stage could stop the maturation of the biofilm by reducing the cell density and preventing cell clumping after an additional 24 h of incubation since the bacterial cells were not eradicated but are dispersed, which can be inferred as a certain level of phage resistant mutant cells. The elimination of bacteria from biofilm structure by phages shows differences in effects regarding the number of phages (individual phage or phage cocktail)46,47,48, the Salmonella serovars, the stage of biofilm maturation, and the composition of biofilm (mixed or single species)49. Combining phage therapy with alternative treatments or antibiotics can be an excellent strategy to eliminate resistant mutant cells and eradicate biofilms. A recent study by Duarte et al.50 described the synergistic activity of a single phage and a phage-derived lytic protein against staphylococcal biofilms, demonstrating that combining phages with lytic proteins might help curtail the development of phage resistance. The combination of phage with antibiotics was also effective against biofilms, as demonstrated by Dickey and Perrot51, showing the prevention of antibacterial-resistant bacteria, mainly when phage was used first and antibiotic second. However, antibiotic/phage combination must be carefully studied once it could increase the distribution of antibiotic resistance genes or have an antagonistic effect, especially with drugs that act inhibiting nucleic acid or protein synthesis52./p> 0.001 and < 0.1, and “Inefficient” for ratios ≤ 0.00122. A Heatmap comparing EOP values was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software)./p> 0.5, “Medium” for 0.2 ≤ v1 ≤ 0.5, “Low” for 0.001 ≤ v1 < 0.2, and “Inefficient” for v1 < 0.001. A Heatmap comparing the v1 score for individual phages and the cocktail was plotted using GraphPad Prism v. 9.1.1 (GraphPad Software). R v. 4.2.2 was used to plot the comparison of EOP and v1 in a dotplot graph./p>

4 × ODc = Strong biofilm producer./p>