Mapeamento da diversidade em tripanossomas africanos usando proteômica espacial de alta resolução

Nature Communications volume 14, número do artigo: 4401 (2023) Citar este artigo

2065 Acessos

26 Altmétrico

Detalhes das métricas

Os tripanossomas africanos são parasitas eucarióticos dixenos que impõem um fardo significativo de doenças humanas e veterinárias na África Subsaariana. A diversidade entre espécies e estágios do ciclo de vida é concomitante com tropismos distintos de hospedeiros e tecidos dentro deste grupo. Aqui, os proteomas espaciais de duas espécies africanas de tripanossoma, Trypanosoma brucei e Trypanosoma congolense, são mapeados em dois estágios de vida. Os quatro conjuntos de dados resultantes fornecem evidências da expressão de aproximadamente 5.500 proteínas por tipo de célula. Mais de 2.500 proteínas por tipo de célula são classificadas em compartimentos subcelulares específicos, fornecendo quatro proteomas espaciais abrangentes. A análise comparativa revela as principais rotas de adaptação parasitária a diferentes nichos biológicos e fornece informações sobre a base molecular da diversidade dentro e entre essas espécies de patógenos.

Os cinetoplastídeos são eucariotos flagelados unicelulares que incluem parasitas importantes de humanos, gado e espécies de plantas cultivadas e são normalmente transmitidos por invertebrados. Dentro desta classe estão os tripanossomas africanos, que infectam coletivamente uma variedade de mamíferos e causam a tripanossomíase humana e animal africana. A maioria das pesquisas que caracterizam os tripanossomas africanos foram realizadas com Trypanosoma brucei; em parte porque duas subespécies são infecciosas para humanos, também, a relativa facilidade de cultura in vitro e manipulação genética desta espécie. T. brucei foi estudado como um parasita, mas também como um organismo modelo divergente, com características biológicas de interesse eucarióticas bem conservadas e não canônicas. As espécies relacionadas, Trypanosoma congolense e Trypanosoma vivax são os principais agentes causadores da tripanossomíase bovina. Apesar da sua importância veterinária, consideravelmente menos pesquisas ocorreram sobre estas espécies1. Diferentes espécies de tripanossomas africanos têm características celulares e de infecção distintas, mas a base molecular de grande parte disto é desconhecida2,3,4,5.

Os tripanossomas africanos estão expostos a uma variedade de ambientes externos diferentes durante o seu ciclo de vida e os parasitas diferenciam-se entre uma série de fases de vida, cada uma adaptada para o crescimento e sobrevivência no seu ambiente actual ou pré-adaptada para o próximo6. Cada estágio de vida é baseado em uma arquitetura celular de núcleo polar comum e altamente organizada, com um único flagelo e uma coleção de organelas de cópia única e múltipla. Os tamanhos relativos, posições e conteúdo proteico das organelas variam entre os estágios da vida. Como em todas as células eucarióticas, a localização subcelular de uma proteína nos tripanossomas não só define o ambiente bioquímico dessa proteína, mas também o potencial para interações moleculares. Conseqüentemente, a função da proteína está intimamente ligada à localização da proteína.

Existem duas abordagens principais para determinar a localização de proteínas em uma célula: microscopia e proteômica. A microscopia permite a resolução precisa de localizações específicas; pode detectar variação entre células dentro de uma amostra; e pode identificar prontamente proteínas localizadas em múltiplos locais, embora possa sofrer de artefatos de marcação ou expressão inadequada. Devido à necessidade de obter um anticorpo específico para uma proteína ou de manipular geneticamente a proteína de interesse, a microscopia é geralmente limitada a um pequeno número de proteínas por estudo. As análises microscópicas de todo o proteoma são conjuntos de dados valiosos e ricos, mas empreendimentos não triviais e demorados que até agora estão limitados a poucas espécies: Saccharomyces cerevisiae7, Humanos8 e T. brucei9.

A proteômica espacial, baseada no isolamento ou enriquecimento de organelas seguido de espectrometria de massa (MS), permite a identificação de proteínas enriquecidas em localizações subcelulares específicas - geralmente sem a necessidade de modificação genética. Esses métodos têm sido altamente eficazes na revelação de proteínas residentes em organelas ou estruturas dentro dos tripanossomatídeos, como mitocôndrias, glicossomos, flagelo e núcleo . Métodos baseados em MS de alto rendimento agora podem ser usados para localizar sistematicamente milhares de proteínas em um único experimento para múltiplas condições, estados ou tipos de células15,16,17,18,19,20,21,22. Tais métodos incluem hyperLOPIT (localização hiperplexada de proteínas organelas por marcação isotópica) . Esta é uma abordagem proteômica quantitativa pela qual um mapa espacial do proteoma pode ser resolvido sem a necessidade de isolamento de organelas individuais possibilitado pela aplicação de algoritmos de aprendizado de máquina . O HyperLOPIT e metodologias LOPIT relacionadas têm sido utilizadas para gerar mapas espaciais de tipos de células de mamíferos, insetos, leveduras, plantas e protozoários .

0.85 for all pairwise comparisons), demonstrating the reproducibility between experimental iterations (Supplementary Fig. 7 and Supplementary Data 8)47. Next, to define the spatial proteomes for each cell-type, final classifications were generated by performing TAGM-MAP analysis on each combined 33-plex dataset (Fig. 1A and Supplementary Data 9). Using this approach, 2679 and 2795 proteins were classified in T. brucei BSF and PCF respectively (Fig. 3A, B and Supplementary Data 9). In T. congolense, 2507 and 2504 proteins were classified in the BSF and PCF respectively (Fig. 3A, B and Supplementary Data 9). These four spatial proteomes provide a comprehensive localisation dataset for two closely related species, across two life-stages each, which has not been achieved on this scale before in any parasitic organism./p>

1e3; Average Reporter S/N > = 5; Isolation Interference <= 50%32. PSMs matching to contaminants (cRAP and cRFP) and those with missing values in any of the 11-plex TMT quantitation channels were removed. PSM intensities were sum-normalised then median-aggregated to the protein level. Each 11-plex TMT experiment was then concatenated to form a 33-plex dataset and proteins with missing values in any of the experiments were removed35./p>0.999 and separately an outlier probability <5 E-5. Proteins that did not meet the thresholding criteria were designated as ‘unknown’. To assess the reproducibility of classifications produced by individual experimental iterations, TAGM-MAP was also performed with the default settings on each 11-plex dataset separately. Classifications were retained if they exceeded a localisation probability >0.99. To assess the variability in classification between the experiments, datasets were compared pairwise using the adjusted Rand index which assigns a score of 0 if consistency is what is expected at random and 1 for perfect consistency using the R package mmclust (v1.0.1)47. To avoid inflating or deflating the ARI due to an excess of “unknown” allocations these were filtered before comparison. Analysis using TAGM-MCMC was then used to provide insight into proteins that were unknown according to TAGM-MAP where it could be due to dynamic protein localisation. This model was implemented using Markov-chain Monte-Carlo. The collapsed Gibbs sampler was run in parallel for 9 chains (T. brucei) and 4 chains (T. congolense) with each chain run for 10,000 iterations. Convergence was assessed using the Gelman-Rubin’s diagnostic and all Markov chains were retained for T. congolense; whilst for T. brucei the best two chains were retained. No thresholding criteria was applied with protein allocations and compartment joint probabilities are reported. Joint probabilities were used to evaluate proteins that may exhibit localisation to more than one compartment./p>=2X the number of genes versus the counterpart in T. brucei or T. congolense accordingly. Cases of two-one gene count orthogroups in T. brucei-T. congolense where two fasta header identifiers matched to a single gene identifier were removed from this set in T. brucei./p>