O modelo de conjuntiva in vitro 3D de espessura total permite a diferenciação de células caliciformes

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 12261 (2023) Citar este artigo

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A cultura in vitro e a geração de células caliciformes altamente especializadas ainda são um grande desafio em equivalentes in vitro 3D conjuntivais. Um modelo que compreende todos os fatores fisiológicos, incluindo células caliciformes secretoras de muco, tem potencial para atuar como uma nova plataforma para estudos sobre doenças conjuntivais. Isolamos células epiteliais conjuntivais primárias e fibroblastos de biópsias humanas. Modelos 3D foram gerados a partir de camadas epiteliais ou de uma combinação delas com um equivalente de tecido conjuntivo. Modelos epiteliais foram investigados quanto à expressão de marcadores e função de barreira. Modelos de espessura total foram analisados ​​​​para morfologia de células caliciformes e expressão de marcadores via imunofluorescência e PCR quantitativo em tempo real. Modelos epiteliais simples cultivados na interface ar-líquido mostraram epitélios multicamadas estratificados com queratinização patológica e sem formação de células caliciformes. A combinação com um equivalente de tecido conjuntivo para gerar um modelo de espessura total levou à formação de um epitélio estratificado multicamadas não queratinizado e induziu a diferenciação de células caliciformes. Em nosso modelo, uma alta semelhança com a conjuntiva natural foi alcançada pela combinação de células epiteliais conjuntivais com fibroblastos incorporados em um hidrogel de colágeno como equivalente de tecido conjuntivo. No futuro, nosso equivalente in vitro conjuntival permitirá a investigação da diferenciação de células caliciformes, patologias conjuntivais, bem como testes de drogas.

A conjuntiva contribui para o filme lacrimal da superfície ocular ao secretar muco suavizante1,2. As funções cruciais da conjuntiva são a proteção contra influências mecânicas e patogênicas e a capacidade de reagir a substâncias nocivas e alérgenos pela produção de muco regulada por IgE e eosinófilos3. Através deste mecanismo, a conjuntiva contribui para o sistema imunológico privilegiado da superfície ocular. Influências adversas como flutuações na umidade, doença do olho seco, alérgenos, infecções e reações autoimunes, por exemplo, síndrome de Stevens-Johnson ou penfigóide da membrana mucosa, podem causar destruição conjuntival e eventualmente cegueira4,5.

Intercaladas no epitélio não queratinizado de 2 a 9 camadas de células escamosas e colunares estratificadas estão células caliciformes altamente especializadas. Suas mucinas secretadas contribuem para o filme lacrimal para garantir uma superfície ocular lisa. Uma alta porcentagem da parte interna das células caliciformes é preenchida por vesículas que contêm muco, enquanto os núcleos das células estão localizados em sua face basal6. Em geral, as mucinas são dependentes de tecido e separadas em duas classes: mucinas associadas à membrana e mucinas secretadas. No contexto do epitélio conjuntival, foram identificadas as mucinas associadas à membrana MUC1, MUC4 e MUC16, bem como a mucina formadora de gel secretada MUC5AC e o MUC7 solúvel secretado . As células caliciformes conjuntivais expressam principalmente MUC5AC e, em menor extensão, MUC161,8,9. Sistemas de teste conjuntival in vitro usando cultura 2D e 3D abordando conjuntivite, olho seco, migração de fibroblastos de pterígio, fibrose e administração de medicamentos foram desenvolvidos nos últimos anos e forneceram informações importantes10,11,12,13. Modelos 3D complexos que compreendem toda a estrutura conjuntival foram desenvolvidos por diferentes autores, nos quais um equivalente de tecido conjuntivo foi utilizado como suporte para a cultura de células epiteliais no topo. Nestes estudos foram utilizados arcabouços feitos de Colágeno I, Fibrina ou conjuntiva descelularizada, enquanto matrizes de Colágeno I e Fibrina incluíram células estromais14,15,16. Esses modelos foram capazes de abordar questões específicas de pesquisa conjuntival, incluindo diferenciação, estudos de inflamação e finalidades clínicas. Embora o muco possa ser detectado nestes modelos através de colorações ELISA e Alcianblue/PAS, as culturas de explantes são difíceis de padronizar e os modelos de conjuntiva gerados in vitro apresentam algumas, mas não todas, características. Portanto, ainda há necessidade de um modelo que combine um epitélio estratificado de múltiplas camadas com células caliciformes e coloração específica de MUC5AC dentro de suas estruturas em forma de copo. Além disso, a cultura destas células caliciformes especializadas continua a ser um grande desafio devido a fatores-chave ausentes ou desconhecidos no seu desenvolvimento6.