Triagem não

Nature Communications volume 14, número do artigo: 5294 (2023) Citar este artigo

Detalhes das métricas

Saccharomyces cerevisiae é um carro-chefe da biotecnologia industrial devido à proeminência do organismo na fermentação alcoólica e ao conjunto de ferramentas genéticas sofisticadas disponíveis para manipular seu metabolismo. No entanto, S. cerevisiae não é adequado para produzir em excesso muitos bioprodutos a granel, uma vez que a toxicidade restringe a produção em títulos elevados. Aqui, empregamos um ensaio de alto rendimento para rastrear 108 cepas de levedura acessíveis ao público quanto à tolerância a 20 g L-1 de ácido adípico (AA), um precursor de náilon. Identificamos 15 leveduras tolerantes e selecionamos Pichia occidentalis para produção de ácido cis, cis-mucônico (CCM), precursor do AA. Ao desenvolver um kit de ferramentas de edição de genoma para P. occidentalis, demonstramos a produção em lote alimentado de CCM com título máximo (38,8 g L-1), rendimento (0,134 g g-1 de glicose) e produtividade (0,511 g L-1 h-1 ) que supera todas as métricas alcançadas com S. cerevisiae. Este trabalho nos aproxima da bioprodução industrial de AA e ressalta a importância da seleção de hospedeiros no bioprocessamento.

Historicamente, a levedura de cerveja (Saccharomyces cerevisiae) tem sido o hospedeiro microbiano preferido para a superprodução de combustíveis, produtos químicos e farmacêuticos. No entanto, devido ao baixo valor de muitos produtos químicos e biocombustíveis a granel, as concentrações necessárias para a produção em escala comercial são frequentemente tóxicas para S. cerevisiae e outros organismos modelo. Por exemplo, S. cerevisiae é incapaz de sustentar o crescimento em concentrações baixas a moderadas de butanol (2%)1, vanilina (0,05%)2, benzaldeído (0,1–0,2%)3 e muitos ácidos orgânicos (0,25–2,5%) 4,5,6. Os ácidos orgânicos representam um desafio distinto de bioprocessamento, já que um bioprocesso de ácido orgânico ideal seria realizado em pH ácido, o que simplifica a recuperação a jusante da forma não dissociada e contorna a exigência de manutenção do pH durante a fermentação. No entanto, a toxicidade ácida é inversamente proporcional ao pH, uma vez que os ácidos não dissociados (pH pKa8,9,10.

O ácido adípico é um ácido dicarboxílico C6 utilizado na produção de náilon 6,6. Com uma produção anual de três milhões de toneladas e um mercado global de seis mil milhões de dólares11, o ácido adípico foi classificado como uma “supermercadoria” pelo Departamento de Energia dos EUA12. A procura global de ácido adípico é actualmente satisfeita através de um processo químico que envolve ciclohexano e ácido nítrico, mas este método utiliza recursos petroquímicos e liberta óxido nitroso, um potente gás com efeito de estufa, o que leva à investigação de rotas mais sustentáveis ​​para a sua produção. Não existem rotas naturais para a biossíntese do ácido adípico, mas pelo menos oito vias bioquímicas projetadas foram propostas para a sua bioprodução . Destas vias, grande progresso foi alcançado utilizando a rota do ácido cis, cis-mucônico (CCM). Esta estratégia emprega três enzimas heterólogas, 3-desidroshiquimato desidratase, descarboxilase do ácido protocatecuico e catecol dioxigenase, para a síntese de CCM a partir do 3-desidroshiquimato, um intermediário da via do chiquimato. O CCM é convertido em ácido adípico por meio de hidrogenação pelas enzimas enoato redutase, mas as variantes bacterianas caracterizadas até o momento funcionam mal em hospedeiros de levedura13, alcançando <0,9% de conversão molar de CCM em ácido adípico14. Na ausência de uma enoato redutase ativa em levedura adequada, S. cerevisiae foi projetada para sintetizar CCM com um título, rendimento e produtividade de até 22,5 g L-1, 0,1 g g-1 de glicose e 0,21 g L-1 h−1, respectivamente9,10. Apesar desses avanços, os processos de CCM de levedura são realizados em pH 5–6, que está bem acima do pKa do CCM (3,87) e mantém o ácido em sua forma dissociada para limitar a toxicidade do produto.

Em resposta à baixa tolerância de S. cerevisiae a muitos bioprodutos a granel, o foco mudou para a triagem de espécies de leveduras não convencionais quanto a fenótipos mais adequados para aplicações industriais . A seleção de cepas é um aspecto crítico e muitas vezes esquecido do desenvolvimento de bioprocessos, pois a seleção de um hospedeiro microbiano adaptado ao produto final alvo provavelmente reduzirá as intervenções de engenharia de cepas, simplificará a separação a jusante, limitará a toxicidade do produto e melhorará as métricas gerais do processo16. Por exemplo, Yarrowia lipolytica é um hospedeiro oleaginoso e osmotolerante que é adequado para a produção de ácidos graxos e alcanos17, Kluyveromyces marxianus é uma levedura termotolerante de rápido crescimento18 e Pichia kudriavzevii é um hospedeiro robusto tolerante a ácidos utilizado para a produção de diversos ácidos orgânicos19. Aproximadamente 1.500 espécies de leveduras foram classificadas em mais de 100 gêneros e os repositórios públicos de culturas contêm milhares de cepas distintas de leveduras. A maioria destas espécies de leveduras pode ser cultivada em laboratório com meios padrão20 e grandes avanços na sequenciação do genoma, biologia de sistemas e engenharia de estirpes reduziram drasticamente o custo e o trabalho envolvido na domesticação genética de hospedeiros não convencionais. Kits de ferramentas genéticas sofisticados foram desenvolvidos para diversas espécies de leveduras, incluindo Y. lipolytica21, K. marxianus18 e P. pastoris22, proporcionando novas oportunidades para seleção de hospedeiros além de Saccharomyces.