Desenvolvimento de um biobanco de Plasmodium vivax para ensaios funcionais ex vivo
Malaria Journal volume 22, Número do artigo: 250 (2023) Citar este artigo
Detalhes das métricas
O Plasmodium vivax é a segunda causa mais prevalente de malária, mas continua a ser difícil de estudar devido à falta de um sistema de cultura in vitro contínuo, destacando a necessidade de estabelecer um biobanco de isolados clínicos com múltiplos congelamentos por amostra para utilização em ensaios funcionais. Diferentes métodos de criopreservação de isolados de parasitas foram comparados e posteriormente o mais promissor foi validado. O enriquecimento de parasitas em estágio inicial e tardio e a maturação do parasita foram quantificados para facilitar o planejamento do ensaio.
Para comparar os protocolos de criopreservação, nove isolados clínicos de P. vivax foram congelados com quatro misturas à base de glicerólito. A recuperação do parasita pós-descongelamento, pós-enriquecimento com KCl-Percoll e em cultura in vitro de curto prazo foi medida através de microscopia de lâmina. O enriquecimento de parasitas em estágio avançado por triagem de células ativadas magnéticas (MACS) foi medido. O armazenamento de parasitas a curto e longo prazo a -80 ° C ou nitrogênio líquido também foi comparado.
Das quatro misturas de criopreservação, uma mistura (glicerólito:soro:RBC na proporção de 2,5:1,5:1) resultou em melhora na recuperação do parasita e aumento estatisticamente significativo (P <0,05) na sobrevivência do parasita em cultura in vitro de curto prazo. Um biobanco de parasitas foi posteriormente gerado usando este protocolo, resultando em uma coleção de 106 isolados clínicos, cada um com 8 frascos. A qualidade do biobanco foi validada medindo vários fatores de 47 degelos: a redução média da parasitemia pós-descongelamento (25,3%); a média de enriquecimento após KCl-Percoll (6,65 vezes); e a percentagem média de recuperação de parasitas (22,0%, medida a partir de 30 isolados). Durante a cultura in vitro de curto prazo, a maturação robusta de parasitas em estágio anelar para estágios posteriores (> 20% de trofozoítos, esquizontes e gametócitos) foi observada em 60,0% dos isolados em 48 h. O enriquecimento de estágios maduros de parasitas via MACS apresentou boa reprodutibilidade, com média de 30,0% de parasitemia pós-MACS e média de 5,30 × 105 parasitas/frasco. Finalmente, o efeito da temperatura de armazenamento foi testado, e não foram observados grandes impactos do armazenamento de curto prazo (7 dias) ou longo prazo (7-10 anos) a -80 ° C na recuperação, enriquecimento ou viabilidade do parasita.
Aqui, um método de congelamento otimizado para isolados clínicos de P. vivax é demonstrado como modelo para a geração e validação de um biobanco de parasitas para uso em ensaios funcionais.
Plasmodium vivax é a espécie de parasita da malária com maior distribuição geográfica e é responsável pela segunda maior carga de malária em todo o mundo. Embora a incidência total de P. vivax tenha diminuído globalmente de 20,5 milhões de casos em 2000 para 4,9 milhões de casos em 2021 [1], permanecem obstáculos significativos nos esforços para erradicar este patógeno, incluindo a falta de uma vacina contra P. vivax e o aumento da resistência a medicamentos antimaláricos.
A pesquisa sobre a biologia fundamental do P. vivax tem sido severamente limitada devido à falta de um sistema contínuo de cultura in vitro [2,3,4]. Esta falta de cultura contínua exige o uso de isolados clínicos de P. vivax para investigações experimentais, e o acesso limitado a estes isolados tem dificultado o progresso no avanço do conhecimento sobre este parasita. Recentemente, foram estabelecidas abordagens de cultura in vitro de curto prazo para P. vivax (incluindo em alguns casos o uso de isolados criopreservados) [3, 5, 6], tornando possível realizar ensaios de resistência a medicamentos de ciclo único [3, 7] bem como ensaios de invasão para avaliar o tropismo dos reticulócitos do hospedeiro [8], os efeitos dos anticorpos inibidores da invasão [9,10,11,12,13,14,15,16] e mutantes do receptor do hospedeiro [17, 18]. Há um reconhecimento crescente da importância do biobanco de amostras de doenças infecciosas [19,20,21], incluindo Plasmodium falciparum [22,23,24]. A geração de um biobanco de isolados criopreservados de P. vivax que possam ser descongelados de forma confiável para experimentação posterior (ensaios funcionais, ensaios de expressão gênica, genômica) seria um recurso crítico para novos avanços no campo [4].